Luku I

Johdanto

Fluoresenssi on eräs luminesenssin esiintymismuoto. Fluoresenssiksi kutsutaan parillisten spinien muodostaman elektronisysteemin virittymisen laukeamista. Tällainen kvanttimekaniikan mukaisesti sallittu transitio purkautuu tyypillisesti n. sekunnissa. Käytännössä tämä merkitsee sitä, että kun fluoresoivaa materiaalia valaistaan (viritetään) ultraviolettialueen säteilylähteellä, nähdään tuloksena materiaalille ominaisia fluoresoivia värejä.

Fluoresenssi on ilmiönä tunnettu joitakin satoja vuosia, mutta vasta auringon valon simulointiin tarkoitettujen valonlähteitten, ultraviolettisuotimien, mittalaitteitten ja mittayksikköjärjestelmän kehittymisen myötä ilmiötä on alettu tutkia järjestelmällisesti. Tämän tuloksena on fluoresenssia ja fluoresoivia värejä löydetty luonnosta monesta erilaisesta paikasta niin maalla kuin merelläkin. Lääketieteessä maneetin vihreää fluoresoivaa proteiinia käytetään apuna monessa erilaisessa tutkimuksessa, kuten esimerkiksi geenitutkimuksessa. Fluoresoivia timantteja ja mineraaleja käytetään koruina ja koristeina erilaisissa ympäristöissä. Biologit pyrkivät saamaan lisää tietoa eliöistä fluoresoivien värien avulla, kuten merieliöiden fluoresenssi ja skorpionien fluoresoivat ominaisuudet.

Myös teollisuus on hyödyntänyt fluoresoivien värien ominaisuuksia. Metalliteollisuudessa fluoresoivia värejä käytetäänkin laaduntarkkailussa perustuen ihmisen silmän herkkyyteen pimeässä tietyille aallonpituuksille. Paperiteollisuudessa fluoresoivia värejä käytetään paperin valkoisuusaistimuksen parantamiseen. Rikosten ja yleisen turvattomuuden lisääntyminen on tuonut asiakirjoihin ja seteleihin fluoresoivia värejä käyttävät turvamerkinnät. Automäärien kasvu maanteillä on lisännyt tarvetta parantaa liikenneopasteiden näkyvyyttä ääriolosuhteissa, jolloin uusia kestäviä fluoresoivia materiaaleja käyttämällä voidaan tehdä entistä havaittavampia liikennemerkkejä. Kuluneen vuoden aikana fluoresoivat värit ovat tulleet mukaan myös tiedontallennukseen ja fluoresoivia värejä käyttävän tiedontallennuslaitteen ennustetaankin syrjäyttävän perinteiset tallennusmediat muutaman vuoden aikana.

Lukuisat fluoresoivien värien teolliset sovellukset ja luonnossa esiintyvät fluoresenssit ovatkin johtaneet tarpeeseen kehittää fluoresoivien värien mittausmenetelmiä entistä tarkemmiksi ja yhtenäisemmiksi.

Tutkielmani käsittelee fluoresoivien värien mittaukseen liittyviä tekijöitä kuten erilaisia mittalaitteita, niihin liittyviä suureita, valonlähteitä, mittaustekniikoita, näihin liittyviä virheitä ja niiden analysointia. Edelleen käydään läpi fluoresoiviin väreihin liittyviä standardeja ja metrologiaa. Kahdessa viimeisessä kappaleessa käyn esimerkkien kautta läpi fluoresoivien värien ilmiöitä luonnossa sekä fluoresoivien värien sovelluksia teollisuudessa.

Luku II

Fluoresenssi ja luminesenssi

Fluoresenssi on fysikaalisena ilmiönä eräs luminesenssin esiintymismuoto. Luminesenssilla ymmärretään virittyneen tilan energian tai rekombinoitumisessa vapautuvan energian emittoitumista sähkömagneettisena säteilynä.

Luminesenssi jaetaan kahteen eri tyyppiin sen mukaan millaiset perus- ja viritystilat ovat. Virittyneessä singlettitilassa elektronilla on perustasoa korkeampienergisellä tasolla vastakkainen spin verrattuna toiseen elektroniin, joka on alemmalla energiatasolla eli elektronit ovat parilliset. Triplettitilassa nämä elektronit ovat parittomia eli niiden spinit ovat saman suuntaiset. Singlettitilan spinin ei tarvitse muuttaa suuntaansa palautuessaan takaisin perustilaan virittyneestä tilasta. Triplettitilan spiniltä tuo suunnanmuutos kuitenkin vaaditaan.

Fluoresenssiksi kutsutaan parillisten spinien muodostaman elektronisysteemin virittymisen laukeamista. Tällainen kvanttimekaniikan mukaisesti sallittu transitio purkautuu tyypillisesti n. sekunnissa eli emissionopeus on n. 1/s. Tämä elinikä on se aika, jonka fluoresoiva aine keskimäärin kuluttaa siihen, että viritys laukeaa.

Fosforesenssiksi kutsutaan emissiota, joka seuraa transitioista erilaisten kerrannaisuuksien omaavien tilojen välillä. Tyypillisesti kyse on triplettitilan palautumisesta perustilaansa. Tällaiset transitiot eivät ole sallittuja ja emissionopeus on pieni. Tyypillisesti fosforesenssin eliniät ovat millisekunneista sekunteihin riippuen keskeisesti muista virityksen laukeamiseen liittyvistä prosesseista kuin emissiosta.

Virityksen laukeamiseen kuluvan ajan mukaisesti erilaiset luminesenssin lajit voidaan jakaa kuvan 2.1 kaavion mukaisesti.

Tässä yhteydessä tarkastellaan vain fluoresenssia. Optisissa mittauksissa varsinkin orgaanisten yhdisteiden ja biologisten muuttujien osalta fluoresenssi on otettava huomioon mittausjärjestelyjä suunniteltaessa.

2.1 Jablonskin diagrammi

Sähkömagneettisen säteilyn absorptiota väliaineeseen ja emissiota väliaineesta kuvataan usein nk. Jablonskin diagrammeilla. Kuvassa 2.2 on esitetty eräs Jablonskin diagrammi, jossa on esitetty elektronien perustila sekä tilat ja . Jokainen näistä tasoista voi pitää sisällään useita värähtelytasoja, jotka merkitty numeroilla 0, 1, 2 ja niin edelleen.

Transitiot eri elektronitasojen välillä ovat vertikaalisia. Tällä kuvataan valon absorption hetkellistä luonnetta. Absorption tarvitsema aika on noin sekuntia, joka on riittävän pieni siihen, ettei molekyylissä esiinny ydintenvälisiä siirtymiä. Tätä kutsutaan Frank-Condonin periaatteeksi.

Valon absorptiosta seuraa yleensä useita erilaisia prosesseja. Tyypillisesti fluoresoiva materiaali virittyy jollekin korkeammalle vibraatiotasolle elektronitasoilla ja . Joissakin harvinaisissa tapauksissa molekyylin virittynyt elektroni palautuu nopeasti tason alimmalle vibraatiotasolle. Tätä kutsutaan sisäiseksi konversioksi ja yleensä se tapahtuu noin sekunnissa. Kun fluoresenssin elinaika on n. ekuntia tapahtuu sisäinen konversio yleensä täydellisesti ennen emissiota. Fluoresenssin emissio tapahtuu termisesti tasapainottuneesta tilasta käsin. Kuten absorptiokin, elektronisen transition purkautuminen tuottaa myös virittyneen vibraatiotason. Myös tämä taso hakeutuu termiseen tasapainoon noin sekunnissa.

Molekyylin absorptiospektri kuvaa elektronisesti virittyneiden tilojen vibraatiotasoja ja emissiospektri kuvaa perustilan vibraatiotasoja. Yleisellä tasolla elektroninen viritys ei suurestikaan muuta vibraation energiatasojen sijaintia. Voidaan sanoa, että vibraatioiden rakenteet ovat samanlaisia niin absorptiossa kuin emissiossakin.

Molekyylit tilassa voivat myös läpikäydä konversion ensimmäiselle triplettitilalle . Emissio tilalta perustilalle on kielletty. Tällaisen tilan purkautuminen on muutamia kertaluokkia hitaampaa kuin fluoresenssin. Tätä ilmiötä kutsutaan fosforesenssiksi.

2.2 Stokes-siirtymä

Fluoresenssin emissiospektrin ominaisuuksista on huomattava Stokes-siirtymä, jolla tarkoitetaan sitä, että emissio havaitaan poikkeuksetta pitemmillä aallonpituuksilla kuin absorptio eli prosessissa häviää energiaa. Eräs syy tähän on elektronien nopea vaimeneminen :n alemmalle vibraatiotasolle. Tämän lisäksi fluoresoivat materiaalit vaimenevat virittyneille :n tasoille. Stokes havaitsi ilmiön vuonna 1852 kuvan 2.3 koejärjestelyllä.

UV-valonlähteenä toimi auringonvalo ja sininen lasisuodin. Eksitaatiovalon pääsy detektorille estettiin keltaisella viinilasilla. Kiniinin fluoresenssipiikki on 450 nm kohdalla (kuva 2.4) ja havaitaan täten selvästi paljaalla silmällä.

Näiden ilmiöiden lisäksi fluoresoivat aineet voivat ilmaista suurempaa Stokes-siirtymää johtuen liukenemisilmiöistä sekä viritystilojen reaktioista.

Kaasufaasissa Stokes-siirtymää ei aina havaita. Siirtymättömiä emissioita voidaan havaita silloin kun kaasun konsentraatiot ovat suhteellisen pieniä, jolloin molekyylit eivät törmää keskenään muiden molekyylien kanssa ennen emissiota. Tällaiset törmäykset ovat virittymisen purkautumisen lähde. Nestefaasissa törmäykset ovat jatkuvia.

Sama fluoresenssin emissio on yleensä havaittavissa riippumatta virittävän säteilyn aallonpituudesta. Virityksen aikana korkeampien elektroni- ja vibraatiotasojen energia kuluu nopeasti, jättäen fluoresoivan aineen alimmalle :n vibraatiotasolle. Tämä relaksaatio tapahtuu noin sekunnissa ja on todennäköisesti tulosta vahvasta päällekkäisyydestä useiden tilojen kesken, joilla on jokseenkin sama energia. Tästä nopeasta relaksaatiosta johtuen emissiospektri on riippumaton virittävästä aallonpituudesta.

Poikkeuksena edellisestä jotkin aineet, kuten atsuleeni, voivat emittoida molemmilta tasoilta ja . Lisäksi absorptiospektrin erittäin voimakkaan punareunan viritys tuottaa punasiirtyneen emission. Tämä johtuu siitä, että punareunan viritys virittää ne fluoroforit, jotka voivat reagoida voimakkaimmin vuorovaikutuksessa liuottimen kanssa.

2.3 Fluoresenssin emissiospektrin peilikuvailmiö

Fluoresenssin emissiospektrissä ilmenee peilikuvailmiö, joka tarkoittaa sitä, että fluoresenssin emissiospektri on peilikuva absorptiospektristä. Tämä ilmiö esiintyy varsinkin silloin kun absorptio tapahtuu transitiona tasolta tasolle .

Spektrien symmetrisyys johtuu siitä, että samat transitiot osallistuvat niin absorptioon kuin emissioonkin sekä ja tasojen vibraatioenergioiden samankaltaisuuksista. Monissa molekyyleissä nämä energiatasot eivät ole merkittävästi muuttuneet erilaisten :n ja elektronijakautumien vaikutuksesta.

Franck-Condonin periaatteen mukaan kaikki elektronien transitiot ovat vertikaalisia, mikä tarkoittaa sitä, ettei ydinten asema muutu. Tästä seuraa, että mikäli tietyn transition todennäköisyys nollannen ja toisen vibraatiotason välillä on suurin absorptiossa, käänteinen transitio on yhtä todennäköinen emissiossa. Tätä transition todennäköisyyttä kutsutaan myös Frank-Condonin tekijäksi. Kuvassa 2.5 on esitetty kuvat peilikuvailmiöstä ja Frank-Condonin tekijästä.

Peilikuvasäännön täsmällinen testaaminen edellyttää, että niin absorptio- kuin emissiospektrikin on esitettävä sopivissa yksiköissä. Lähimmäksi symmetriaa pitäisi päästä silloin kun käytetään sovitettuja spektrejä ja F, missä on vaimennuskerroin aaltoluvulle ja F on suhteellinen fotonivuo yli aaltolukuvälin . Näiden kahden spektrin yhteensovitus on yleensä löydettävissä polynukleaarisille aromaattisille hiilivedyille.

Peilikuvasääntöön on olemassa myös poikkeuksia. Esimerkiksi bifenyylin absorptiospektrissä ei ole havaittavissa rakennetta, mutta emissiospektrissä vibraatiotasot erottuvat selvästi.

Nämä peilikuvasäännön puutteet kertovat yleensä siitä, että ytimellä on erilainen geometrinen muoto viritetyssä tilassa kuin perustilassa. Ydinten poikkeamat ovat mahdollisia johtuen tilan suhteellisen pitkästä elinajasta. Tässä bifenyylin tapauksessa siis emissiospektri on hienojakoisempi kuin absorptiospektri, mikä on poikkeuksellista. Yleensä asia on juuri päinvastoin.

Myös muut virittyneiden tilojen reaktiot kuin geometriset siirtymät voivat aiheuttaa poikkeuksia peilikuvasääntöön. Esimerkiksi fenoli ja tyrosiini antavat kumpikin kaksi emissiota. Pitkän aallonpituuden emissio on seurausta suuresta protoniakseptoreiden määrästä. Fenolihydroksyyliryhmän happovakio laskee perustilan 11:sta viritetyn tilan 4:ään. Virittymisessä fenolin protonit menettävät protoniakseptoreita liuokseen. Riippuen näiden akseptoreiden konsentraatiosta fenoli tai fenolaatti voi dominoida emissiospektriä.

Vaikka useat polynukleaariset aromaattiset hiilivedyt ovat vailla reagoivia ryhmiä, ne käyvät myös läpi virittyneiden tilojen reaktioita. Esimerkiksi viritetty pyriini muodostaa varauksenkuljettajakompleksin itsensä kanssa. Polynukleaariset aromaattiset hiilivedyt voivat muodostaa varauksenkuljettajia myös muiden hiilivetymolekyylien kanssa.

Molekyylien fluoresenssia tarkasteltaessa on huomattava, että perustilan alimmalta tasolta viritetyn tilan alimmalle tasolle tapahtuvalla absorptiolla on sama aallonpituus kuin vastaavalla emissiolla. Kyseessä on nk. Resonanssifluoresenssi eli sisäinen fluoresenssi. Tätä havaitaan vain harvoin, sillä se vaikuttaa molekyylin sisällä.

Fluoresenssispektrejä tarkasteltaessa on otettava huomioon Stokes-siirtymän lisäksi myös sironnat ja anti-Stokes -siirtymä. Anti-Stokes -siirtymä syntyy kun absorptio esiintyy alemmasta :n vibraatiotasosta, jolloin emittoituvan säteilyn aallonpituus on lyhyempi kuin virittävän säteilyn.

Aineet, joissa fluoresenssia esiintyy, voidaan jakaa kahteen luokkaan fluoresenssin tyypin mukaan. Aineessa voi esiintyä luonnollista fluoresenssia tai fluoresenssi esiintyy vain jos siihen kohdistetaan sähkömagneettista säteilyä ulkoapäin.

Luminesenssiin sisältyy fluoresenssin ja fosforesenssin lisäksi muitakin ilmiöitä, jotka esitellään tarkemmin ilmiöihin liittyvissä luvuissa.