Luonnossa fluoresoivia värejä esiintyy monessa eri yhteydessä. Timanttien ja mineraalien fluoresoivat värit johtuvat erilaisista virheistä ja epäpuhtauksista kiderakenteessa. Skorpionin, maneetin ja merieliöiden fluoresoivat värit liittyvät niiden vuorovaikutukseen ympäristönsä kanssa.
Hyvä esimerkki fluoresenssista luonnossa on fluoresoivat timantit. Tässä käytän esimerkkinä intialaista alkuperää olevaa Tavernier-timanttia, joka fluoresoi sinistä väriä. Intian kaivosten lisäksi Etelä-Afrikan kaivosten timanteissa esiintyy fluoresenssia.
Timanttien värimittaukset aloitettiin 1930-luvulla värittömillä ja kellertävillä timanteilla. Mittauksissa käytettiin apuna trikromaattista värimittaria, sekä timanttivärimittaukseen suunniteltuja värien vertailulaitteita. Ensimmäisessä laitteessa timantin väriä verrattiin kiilamaiseen värittömään lasinpalaseen. Toinen laite oli värimittari, jossa oli kaksi eri detektoria, toinen keltainen ja toinen sininen. Väri määriteltiin kahdesta detektorista saatujen arvojen suhteesta. Edellisten mittareitten pohjalta kehitettiin Okuda-timanttivärimittari. Parannuksena edelliseen oli se, että timantti asetettiin integroivan pallon keskipisteeseen. Nykyiset timanttien värimittauslaitteet perustuvat juuri tähän integroivan pallon käyttöön. Y. Liun ja J. Shigleyn mukaan timanttivärien heijastusmittauksissa päästään lähemmäksi oikeita visuaalisia arvoja käyttämällä 0/d-geometriaa.
Aleksandriitti-ilmiö on tärkeä ilmiö timanttivärimittauksissa. Tässä ilmiössä värimuutos materiaalissa on huomattavaa, kun sitä tarkastellaan erilaisissa valonlähteissä. Vain muutamat timantit näyttävät eri värisiltä valaisulähdettä muutettaessa. Aleksandriitti-ilmiötä havaitaan yleisemmin ilmiön mukaan nimetyissä aleksandriittikrysoberylleissä, jotka näyttävät sinertävän vihreiltä päivänvalossa ja punertavan purppuralta keinovalossa. Värisävykulman ero voi olla jopa 180° sylinterikoordinaatistossa (toisin sanoen ne ovat opponoivia värejä), kun näytteitä tarkastellaan näissä kahdessa eri valonlähteessä.
Aleksandriitti-ilmiön havainnollistamiseen on käytetty Tavernier-timanttiperheeseen kuuluvaa timanttia, joka lähettää vahvaa sinistä fluoresenssia pitkällä UV-alueella valaistaessa. Heikompi reaktio syntyy myös lyhyemmällä UV-alueella valaistaessa. Tavernier-timantti on 56.06 karaatin (1 karaatti = 0.2 grammaa) päärynän muotoinen timantti. Timantti on keinovalolla valaistaessa väriltään ruskea ja muuttuu päivänvalolla valaistaessa vaaleanpunaiseksi. Timantin avulla voidaan osoittaa, että kun timanttia valaistaan päivänvalolla, fluoresoivat ominaisuudet saavat aikaan aleksandriitti-ilmiön. Timantti kuuluukin ryhmään timantit, jotka fluoresoivat sinistä väriä ja jotka ovat liukaspintaisia.
Timantilla on hiilirakenne ja timantin eri värit johtuvat atomi-epäpuhtauksista, erilaisista kiderakenteen virhekeskuksista tai atomidislokaatiosta timantin kiderakenteessa. Fluoresenssi timanteissa johtuu typpiepäpuhtaudesta.
Timantin spektri mitattiin käyttäen valaisulähteenä ksenonlampulla varustettua D65 päivänvalosimulaattoria. Spektri sisältää sekä heijastus- että fluoresoivan komponentin. Seuraavaksi vertaillaan timantin värilaskelmien tuloksia ja timantin ulkonäköä eri tilanteissa perustuen amerikkalaiseen tutkimukseen [10].
Kuva 8.1. Esittää Tavernier-timanttia keinovalossa, jossa se näyttää vaalean ruskealta (oranssi värisävy).
Kuvassa 8.2 on Tavernier-timantti päivänvalossa, jossa se näyttää vaalean punaiselta.
Kuvassa 8.3 on Tavernier-timantti pitkän UV-alueen valolla valaistuna. Tällöin timantti fluoresoi voimakkaasti sinistä väriä.
Tarkasteltaessa timanttia kymmenkertaisella suurennoksella timanttimikroskoopilla, pinnan väritys näyttää levinneen tasaisesti, vaikkakin siitä löytyy joitakin ruskeita rinnakkain olevia vöitä. Nämä kuviot näkyvät myös eri suuntiin polaroivia suotimia käytettäessä.
Infrapunaspektri osoittaa että Tavernier-timantti kuuluu timanttiluokkaan IaA < B [11]. Timantin absorptio-ominaisuuksien mukaan pääepäpuhtausatomi on typpi, jota esiintyy useissa erilaisissa atomiagregaattimuodoissa. Nämä sisältävät A- ja B-viat, N3-keskukset ja isommat mikroskooppiset levymäiset agregaatit, jotka ovat typpeen liittyviä vikoja. N3-keskukset aiheuttavat timantin sinisen fluoresenssin ja vaikuttavat timantin väriin. Timantin ruskean värin arvellaan johtuvan atomitason vioista, jotka muodostuivat timantin vielä ollessa maaperässä [10].
CCD-spektrografijärjestelmää käytettiin mittaamaan timantin transmittanssia fluoresenssissa ksenon D65 päivänvalolähteellä. Lisäksi timantin transmittanssi mitattiin spektrofotometrillä ilman fluoresenssia. Molemmat mittaukset suoritettiin huoneen lämmössä. CCD-detektorissa on termoelektrinen ilmajäähdytys, jotta järjestelmä saadaan vakaaksi [10]. Kuvassa 8.4 on fluoresenssitransmittanssikuvaajan mittaamiseen tarkoitetun CCD-spektrografin optisen osan kaavakuva.
Ksenon D65 päivänvalosimulaattorissa on kaksi suodinta. Toinen suotimista on värjätty lasisuodin ja toinen on diffuuseri. Värjätyllä lasisuotimella on kolme eri merkitystä. Lasisuodin nostaa värilämpötilan 5500-6500 kelviniin, poistaa ultraviolettisäteilyn 300 nm:n alapuolelta ja absorpoi lämpöä. Diffuuserin avulla valo pystytään levittämään tasaisemmin koko alueelle.
Kuvassa 8.5 on ksenon- D65-päivänvalosimulaattorin ja standardivalaisulähteen D65 spektrisen tehojakauman kuvaajat. Kuvaajat ovat melkein samanlaiset.
Kuvassa 8.6. on spektrofotometrillä mitattu timantin transmittanssikuvaaja.
Kuvaaja on tyypillinen timanteille, joilla on N3 keskus. Koska N3-keskuksen aiheuttama sininen fluoresenssi johtuu suurelta osin UV-säteilystä, ei näkyvän valon aiheuttamaa säteilyä tarvitse ottaa huomioon. Kuvassa 8.7 on CCD-spektrografilla mitattu transmittanssikuvaaja (1) D65 päivänvalolähteellä. Spektri koostuu kahdesta osasta. Toinen osa on kuvan 8.6 tyyppinen transmittanssikuvaaja ja toinen on fluoresenssikuvaaja, joka johtuu UV-sätei-lystä. Vertailun vuoksi kuvassa 8.7 on myös fluoresoimattoman timantin transmittanssikuvaaja (2).
Fluoresenssin sisältämä transmittanssikuvaaja on normeerattu ei-fluoresenssikuvaajan mukaan aallonpituudella 560 nm. Timantin suhteellinen fluoresenssi-intensiteetti saadaan vähentämällä fluoresenssia sisältämätön transmittanssikuvaaja fluoresenssikuvaajasta normeerauksen jälkeen. Kuvassa 8.8 on tällä menetelmällä määritetty suhteellinen fluoresenssi-intensiteettikuvaaja. Kuvaaja on tyypillinen sinisen fluoresenssin spektri, jonka aiheuttaa timantin rakenteen N3-keskus [10].
Taulukossa 8.1 ovat kuvan 8.6 transmittanssikuvaajan värikoordinaatit.
| Valaisulähdea | L* | a* | b* | C | hab |
| A | 73.74 | 2.50 | 5.95 | 6.45 | 67.2 |
| D65 | 73.35 | 0.39 | 5.88 | 5.89 | 86.2 |
| F7 | 73.35 | -0.02 | 6.04 | 6.04 | 90.2 |
a Valaisulähteitten A ja D65 välinen kulma on 19.0° . Valaisulähteitten D65 ja F7 välinen kulma on 4.0° .Valaisulähteitten A ja F7 välinen kulma on 23.0°.
Laskettu värisävykulmaero on 67.2° valaisulähteessä A, 86.2° valaisulähteessä D65 ja 90.2° valaisulähteessä F7. Värisävyn muutos A- ja F7-valaisulähteiden välillä on 23.0° . Arvo on suurempi kuin 20° , jota käytetään kriteerinä arvioitaessa sitä tapahtuuko timantissa aleksandriitti-ilmiötä vai ei. Tässä valaistusympäristössä timantti kuuluu ryhmän 4 aleksandriitti-timantteihin. Tämän luokan timanteissa värimuutos on melko pientä.
Taulukkoon 8.2 on laskettu spektrisen transmittanssikuvaajan värikoordinaattiarvot D65-valonlähteessä, joka on kuvassa 8.7.
| Valonlähdea | L* | a* | b* | C | hab |
| D65 | 69.3 | 3.41 | -0.83 | 3.51 | 346.3 |
a Koska valonlähteet A ja F7 eivät aiheuta kuvan 8.7 fluoresenssia, niille ei ole laskettu värikoordinaatteja.
Sävykulma on 346.3° D65 päivänvalosimulaattorissa. Kun taulukkojen 1 ja 2 arvoja verrataan keskenään sävykulman eroksi saadaan 80.9° . Arvo vastaa havaittua värimuutosta timantissa [10].
Mineraaleja on löydetty 3600 erilaista, joista noin 500 on fluoresoivia. Mineraalien fluoresenssi-ilmiö johtuu niin kutsutuista aktivaattoreista. Yleensä aktivaattorit ovat epäpuhtauksia mineraalin normaalissa molekyylirakenteessa, mutta on myös tapauksia, joissa fluoresenssin aiheuttaja on normaali osa mineraalin rakennetta. Fluoresoivissa mineraaleissa aktivaattoreina toimivat yleensä kationit, jotka ovat atomeja tai molekyylejä, joiden kokonaisvaraus on positiivinen. Esimerkiksi kalsiitin kirkkaanpunainen fluoresenssi johtuu mangaanikationista Mn+2. Yläindeksi merkitsee sitä, että mangaani-atomi on luovuttanut kaksi elektronia ja sillä on täten kokonaispositiivinen varaus. Myös anionit voivat toimia joissain tapauksissa aktivaattoreina. On olemassa epäpuhtauksia, jotka estävät fluoresenssin vaikka mineraali sisältäisikin aktivaattoreita. Näitä epäpuhtauksia kutsutaan deaktivaattoreiksi [12].
Eräät mineraalit fluoresoivat puhdasrakenteisina. Näitä mineraaleja kutsutaan itseaktivoituviksi mineraaleiksi. Itseaktivoituviin mineraaleihin kuuluvat scheeliitti, powelliitti, eräät uraanin mineraalit, benitoiitti, serusiitti ja anglesiitti. Scheeliitin fluoresenssi on usein väriltään taivaansinistä kuten kuvasta 8.9 nähdään.
Useat uraanin mineraalit, kuten autuniitti, fluoresoivat kirkkaankelta-vihreää väriä. Tämä väri johtuu uranyyli-ionista. Tämä ioni on huomattavan fluoresoiva, joten pienikin määrä uranyyli-ionia aiheuttaa keltavihreää fluoresenssia. Esimerkiksi adamiitin, apofylliittin, aragoniitin, kalsiitin, kvartsin ja opaalin vihreä fluoresenssi johtuu tästä ionista. Kuitenkaan willemiitin vihreä fluoresenssi ei johdu uranyyli-ionista.
Kalsiitti on hyvin yleinen fluoresoiva mineraali. Kalsiittia esiintyy monena eri fluoresoivana värinä johtuen kalsiitin erilaisista aktivaattoreista. Punainen ja vaaleanpunainen fluoresenssi kalsiiteissa johtuu lyijyn ja mangaanin yhdisteistä. Kuten edellä mainittiin, kalsiitin vihreä väri johtuu uranyyli-ionista. Teksasin elohopeakaivoksilta louhittu kalsiitti on sangen erikoislaatuista. Se fluoresoi vaaleanpunaista pitkällä ultraviolettialueella ja kirkkaansinistä lyhyellä UV:lla. Lisäksi mineraalissa esiintyy kirkkaansinistä fosforesenssia sen jälkeen kun UV-valonlähde on poistettu. Kalsiittinäytteet ovat kuvassa 8.10.
Fluoresenssi on saanut nimensä fluoriitin mukaan. Tämä ei kuitenkaan tarkoita sitä että fluoriitti olisi kaikissa tapauksissa fluoresoivaa. Useat fluoriitit fluoresoivat sini-violettia väriä europium-epäpuhtauksien takia. Kuvassa 8.11 on fluoriitti.
Willemiitti, sinkin mineraali, fluoresoi kirkkaankelta-vihreää väriä. Tämä fluoresenssi johtuu mangaaniepäpuhtauksista. Kuvassa 8.12 willemiitti-kalsiittinäyte.
Skapoliitti fluoresoi oranssi-keltaista väriä pitkällä UV-alueella. Lyhyt UV-valolähde aiheuttaa skapoliitissa fosforesenssia, jota voidaan vahvistaa asettamalla näytekappale kuuman veden alle. Ilmiötä kutsutaan termoluminesenssiksi. Kuvassa 8.13 on skapoliitti.
Yhdysvalloissa New Jerseyn osavaltiossa sijaitsevaa Franklinin kaupunkia kutsutaan maailman fluoresoivien mineraalien pääkaupungiksi. Lähellä sijaitsevan Ogdensburgin kaupungin kaivosten kanssa näistä paikoista löytyy yhteensä noin 260 mineraalia, joista 56 on fluoresoivia. Joitakin mineraaleista ei ole löydetty maapallolta kuin pelkästään Franklinin alueella. Franklinin kaivos on ainoita kaivoksia maailmassa, jonka mineraalinäytteessä voi esiintyä jopa viittä erilaista fluoresoivaa mineraalia. Yleisimmät fluoresoivat mineraaliyhdistelmät tällä alueella ovat willemiittikalsiitti-yhdistelmiä [13,14,15].
Elokuussa 1999 mitattiin Perkin-Elmer fluorometrillä joukko Suomen geologian laitokselta peräisin olevia fluoresoivia mineraaleja. Mittaus on ensimmäinen laatuaan Suomessa.
Sekä viritys- että emissiopuolella käytettiin kaikissa mittauksissa 10 nm kaistanleveyttä ja suurehkoa skannausnopeutta. Tässä tulee myös ottaa huomioon, että mineraaleja ei oltu eroteltu muusta kiviaineksesta ja tämä osaltaan vaikutti mittaustuloksiin.
Fluoresoivia mineraalinäytteitä oli kerätty eri puolilta maapalloa. Tässä käsittelen mineraaleista niitä, joiden fluoresenssiominaisuudet olivat mielenkiintoisimpia. Mineraalien joukosta valittiin mitattavaksi willemiitti-kalsiittikimpale (Afrikka), kalsiitti (Ruotsi), zirkoni (Siilinjärvi-Suomi), uraanisuola (Pohja-Suomi) ja tugtubiitti (Grönlanti)
Mineraalinäytteitä testattiin visuaalisesti ensin kahdella erilaisella UV-lampulla. Ensin UV-C -alueen (252 nm) putkella ja sitten UV-A -alueella (365.5 nm) säteilevällä lampulla. Yksittäinen kalsiittinäyte muuttui kummallakin UV-alueella hehkuvan punaiseksi. Zirkonia kokeiltaessa se fluoresoi UV-valossa keltaista väriä. Willemiitti-kalsiittinäyte muuttui UV-valossa odotusten mukaisesti puna-vihreäksi (kuten kuvassa 8.12). Uraanin pinnalla olleet uraanisuolat "hehkuivat" vihreää väriä. Uraanisuolan vihreä väri katosi näytettä raaputettaessa. Tästä voidaan päätellä, että uraanisuolan fluoresoiva kerros on erittäin ohut.
Kiinnostavimmaksi mineraaliksi osoittautui kuitenkin Grönlannista peräisin oleva tugtupiitti. Näyte on peräisin Kvanefjeldin alueelta Grönlannista. Sana tugtup on eskimoa ja tarkoittaa poroa (tugtupiitti=porokivi). Tugtupiitti on sukua hackmaniitille (esiintyy Kuolassa ja Grönlannissa) ja niissä kummassakin esiintyy ilmiötä, jota kutsutaan tenebresenssiksi [16,17]. Tenebresenssissä on kyse ilmiöstä, joka tapahtuu kun mineraalia valaistaan lyhyen aallonpituuden UV-valolla (UV C). Tällöin tugtupiitin väri muuttuu voimakkaan vaaleanpunaiseksi. Vahva vaaleanpunainen väri säilyy mineraalissa niin kauan, kunnes mineraalia valaistaan voimakkaalla päivänvalolla tai kirkkaalla keinovalolla. Tällöin vaaleanpunainen väri himmenee huomattavasti. Lisäksi kun näytettä tarkasteltiin UV-A -alueen valossa, näyte muuttuikin hehkuvan oranssiksi. Ilmiö on osin samanlainen kuin joissakin kalsiittilajeissa.
Aluksi näytteitä skannattiin fluorometrin pre-scan-tilassa, jolloin mineraaleista saatiin esille viritysaallonpituudet. Näytteitä oli hankalahko mitata, koska niistä ei löytynyt kovinkaan tasaista mittauspintaa. Usean näytteen kohdalla huomattiin, että fluorometrin prescan-tila antoi eksitaatioaallonpituudeksi 200 nm. Tämä lieneekin fluoresoiville mineraaleille ominainen viritysaallonpituus. Ensin fluorometrillä mitattiin willemiitti-kalsiittinäyte. Näytettä viritettiin 200 nm aallonpituudella. Emissiokuvaajasta huomataan neljä terävää fluoresenssipiikkiä 500 nm molemmin puolin. Näistä voidaankin päätellä, että willemiitille ominainen fluoresoiva väri on todellakin vihreä. Kuvassa 8.14 on willemiitin emissiospektri.
Kuvaajasta huomataan, että voimakasta fluoresenssia esiintyy kautta koko mittausaallonpituuden. Ilmeisesti willemiitti-kalsiittinäytteessä on paljon muitakin mineraaliepäpuhtauksia, jotka fluoresoivat voimakkaasti.
Zirkonia viritettiin myös 200 nm aallonpituudella (kuva 8.15). Emissiospektrin profiili on jälleen fluoresoiville mineraali-kivi yhdistelmille ominainen "vuorimainen" profiili. Zirkonin emissiospektri on melko erikoinen verrattaessa sitä visuaalisiin tuloksiin. Spektri muistuttaa hiukan willemiitin emissiospektriä vaikkakin silmämääräinen tarkastelu antoikin fluoresoivaksi ominaisväriksi keltaisen. Tässäkin näytteen epäpuhtaudet ja vaikea mitattavuus lienevät syynä saatuun tulokseen.
Uraanisuolan emissiospektriä mitattiin viritysaallonpituudella 225 nm. Kuvassa 8.16 on uraanisuolan viritysspektri.
Tarkasteltaessa uraanisuolanäytteen emissiospektriä (kuva 8.17), huomataan voimakas fluoresenssipiikki 500 nm alapuolella. Tämä vahvistaa visuaalisen vihreän fluoresenssihavainnon oikeaksi. Näytteessä esiintyy voimakasta fluoresenssia alueella 300-500 nm, johon vaikuttanevat näytteen muut mineraaliepäpuhtaudet.
Ruotsalaista kalsiittinäytettä viritettiin aallonpituudella 200 nm. Kalsiittinäytteestä löytyi selkeä fluoresenssipiikki 600 nm kohdalta, joka tukee kalsiitista tehtyä punaista fluoresenssi -näköhavaintoa. Spektri on muutenkin selkeästi tulkittava verrattuna edellä käsiteltyihin näytteisiin. Tosin fluoresenssi on heikkoa verrattuna edellisiin näytteisiin. Tämä johtunee siitä, ettei näytettä saatu asetettua fluorometriin riittävän hyvin.
Tugtupiittiinäytettä yritettiin mitata fluorometrillä, mutta koska näytteen tugtupiittiesiintymät olivat mittausteknisesti vaikeissa paikoissa (näytteitä ei ollut lupa hajottaa), ei näytettä saatu mitattua. Tässä tyydynkin vain toteamaan, että jos näyte olisi pystytty mittaamaan fluorometrillä, olisi huomattu, että tietyllä viritysaallonpituudella olisi saatu vaaleanpunainen väri esille ja tietyllä aallonpituudella vastaavasti oranssi väri. Virityksen ja emission suhde näissä kahdessa olisi ollut sama. Mineraalin tenebresenssi olisi myös omalta osaltaan vaikuttanut kiven mittauksiin.
Vihreä fluoresoiva proteiini (Green Fluorescent Protein-GFP) on Tyynenmeren maneetista (latinaksi Aequoria victoria) peräisin oleva fluoresoiva proteiini. Proteiinin tehtävänä on muuttaa energian siirron avulla toisen proteiinin sininen kemoluminesenssi, aequoriini, vihreäksi fluoresoivaksi väriksi. Maneetin arvellaan puolustautuvan saalistajakaloja vastaan fluoresoivan värin avulla.
GFP-molekyylikloonauksen ja eräiden geneettisten kokeiden avulla GFP:stä on tullut merkittävä tekijä esimerkiksi solu-, kehitys- ja molekyylibiologiassa. Vihreän fluoresoivan proteiinin avulla on tutkittu bakteereja, hiivoja, homesieniä, kasveja, kaloja ja nisäkkäitten soluja. GFP toimii solussa proteiini-indikaattorina. Elävien solujen tutkimuksessa GFP:tä voidaan käyttää solun alkuperän selvityksessä, geenitutkimuksessa ja tarkasteltaessa proteiinien vuorovaikutusta toistensa kanssa.
Vihreä fluoresoiva proteiini koostuu 238 aminohaposta. Villi-tyyppiä olevan GFP:n viritysspektrit sijaitsevat 395 ja 470 nm:n kohdalla. Emissiopiikki sijaitsee 508 nm:n kohdalla.
Vihreää fluoresoivaa proteiinia on geneettisesti käsitelty edelleen ja tuloksena ovat autofluoresoivat proteiinit (Autofluorescent Proteins-AFP). Muutokset kromoforisarjoihin ovat mahdollistaneet sinisen, punaisen ja punasiirtyneen fluoresoivan proteiinin valmistuksen.
Vihreän fluoresoivan proteiinin hyvistä ominaisuuksista voidaan mainita seuraavia: Kestää hyvin; lämpötilavaihteluja, pH:n vaihteluja, kemiallisia denaturointiaineita ja proteaaseja. Lisäksi GFP:tä on helppo mitata fluorometreillä ja sen biologinen tila säilyy kauan. [18,19,20]
Edellä mainittiin joitakin vihreän fluoresoivan proteiinin sovelluksia. Tässä käsittelen paria uusinta sovellusta.
Alkuvuodesta 1999 japanilaiset geenitutkijat kehittivät silkkimadon, joka tuottaa vihreää fluoresoivaa kuitua. Tutkijat käyttivät hyönteisen virusta asentaessaan maneetin fluoresoivan geenin naaraspuoliseen silkkiperhoseen. Kun nämä naaraat parittelivat uroksen kanssa, noin kolme prosenttia syntyneistä toukista tuotti fluoresoivaa silkkikuitua. Fluoresoivista toukista syntyneet perhoset parittelivat edelleen seuraavan sukupolven kanssa, jolloin syntyivät vihreää fluoresoivaa silkkiä tuottavat toukat. Tarkoituksena ei ollut kehittää tyylikkäältä näyttävää fluoresoivaa silkkiä, vaan fluoresoivaa geeniä käytetään indikaattorina silkkimadon geenirakenteessa. Esimerkiksi kun tulevaisuudessa kehitetään geeni, jolla silkistä saadaan entistä kestävämpää. Ja kun tämä geeni lisätään silkkimatoon siten, että se korvaa fluoresoivan geenin, huomataan että geeninkorvaustoimenpide on onnistunut. Samaan menetelmään perustuen voidaan silkkimatoon lisätä vieras proteiini kuten hämähäkinsilkkiproteiini, spidroiini, josta pystytään valmistamaan esimerkiksi luotiliivejä ja kestäviä laskuvarjoja [21].
Syyskuussa 1999 englantilaiset tutkijat kehittivät perunan, joka alkaa fluoresoida kun se tarvitsee vettä. Maneetin vihreä fluoresoiva proteiini aktivoituu abskisihaposta, jota kasvi käyttää järjestellessään solujaan uudelleen vedenpuutetta varten. Näiden perunoiden ei ole tarkoitus päätyä ravinnoksi, vaan ne toimivat eräänlaisina vartijaperunoina koko perunapellolle. Yhtä perunapeltoa kohti istutetaan joitakin fluoresoivia perunoita ja niiden lisäksi asennetaan detektori, joka havaitsee perunoiden keltaisen fluoresenssin. Detektoriin on yhdistetty vihreä lamppu, joka syttyy kun perunat tarvitsevat kastelua. Tutkijat arviovat, että näitä perunoita apuna käyttäen maanviljelijät säästävät kastelu- ja lannoituskustannuksissa jopa 2500 markkaa hehtaaria kohti. Perunoita on kaupallisesti saatavilla noin kuuden vuoden päästä.
Tulevaisuudessa tutkijat pyrkivät kehittämään muun värisistä fluoresoivista proteiineista havaitsimia, jotka havaitsevat kasvin nitraatti-, fosfaatti- ja ruokosokeritason [22].
Tässä kappaleessa analysoidaan vuosina 1995 ja 1996 Joensuun yliopiston fysiikan laitoksella mitattuja fluoresoivia proteiininäytteitä, jotka on valmistettu Lappeenrannan teknillisessä korkeakoulussa [23].
Fluoresenssimittaukset tehtiin Shimadzu RF-5000-spektrofluorometrillä. Sekä viritys- että emissiopuolella käytettiin kaikissa mittauksissa 5 nm kaistanleveyttä ja suurta skannausnopeutta, koska sillä ei näyttänyt olevan mitään vaikutusta fluoresenssispektrin muotoon.
Näytteitä oli kolmea erilaista, joihin viittaan kuukausi/vuosi-merkinnällä. Näytteet 11/95 ja 1/96 fluoresoivat silminnähtävästi, kun niitä valaistiin UV-valolla. Näyte 1/96 menetti silminnäkyvän fluoresenssinsa, kun sakka laskeutui. Valkea sakka fluoresoi näkyvästi vaaleanvihreää valoa. 6/96-näyte oli kirkasta nestettä, joka ei fluoresoinut UV-lampulla. Mittaukset osoittivat että myös tällä nesteellä oli tunnusomainen vihreä fluoresenssi, joskin hyvin heikko.
Näytteiden 11/95 ja 1/96 emissiospektreissä nähdään tunnusomainen huippu 507 nm kohdalla, kun viritys tehdään aallonpituudella 395 nm (kuvat 8.20 ja 8.21).
Näytteen 1/96 emission intensiteetti on pienempi kuin näytteen 11/95, kuten voidaan helposti todeta kuvista 8.20 ja 8.21. Syynä on ilmeisesti sakan laskeutuminen kyvetin pohjaan mittauksen aikana.
507 nm piikin kyljessä on 460 nm kohdalla "olkapää", joka kasvaa, kun viritysaallonpituutta lyhennetään. 355 nm virityksellä (vastaa Nd-YAG-laserin 3. harmonista viivaa, laseria käytettiin virityksessä tarkasteltaessa GFP:n fluoresenssin aikakäyttäytymistä mittausten yhteydessä) emissiospektri on selkeästi kaksihuippuinen ja 460 nm huippu on jopa korkeampi kuin 507 nm (kuvat 8.22 ja 8.23). Fluoresenssin sinivihreä väri johtuu 3. harmonisella viritettäessä juuri tästä.
On huomattavaa, että 507 nm piikki pienenee 340 nm piikin kasvaessa.
Näytteiden 11/95 ja 1/96 viritysspektrit ovat muodoltaan erilaisia. Vyöhykkeiden korkeudet ovat toisinpäin, ja lisäksi pidemmän aallonpituuden vyöhykkeiden maksimiaallonpituudet eroavat n. 20 nm. On huomattava, että 355 nm lyhyempää viritystä ei kokeiltu kuin 6/96 -näytteeseen. 6/96-näyte tutkittiin Perkin-Elmer -fluorometrillä (käsitelty luvun 5-Fluoresoivien värien mittalaitteet yhteydessä). Shimadzu-fluorometrillä optimivirtys joudutaan hakemaan niin kutsutulla multispectral-mittauksella, jossa laite mittaa viisi spektriä peräkkäin käyttäjän määrittelemillä viritysaallonpituuksilla. Tämän vuoksi 11/95 ja 1/96 -näytteiden mittausten pohjana käytettiin Science-lehdessä [19] julkaistuja tuloksia, joissa optimiviritys oli 400 nm tuntumassa.
Tulosten vertailukelpoisuuden vuoksi myös näyte 6/96 mitattiin Shimadzulla. Näytteestä löytyi hyvin heikko vihreä (507 nm) emissio 395 nm virityksellä (kuva 8.24).
Spektrin muoto on samanlainen kuin näytteessä 11/95 (kuva 8.20). Samoin oli 507 nm aallonpituudella mitattu viritysspektri (kuva 8.25) aivan samankaltainen kuin näytteellä 11/95 (kuva 8.26). Intensiteetti on vain paljon pienempi.
300 nm virityksellä saatiin fluoresenssihuippu n. 338 nm kohdalla (kuva 8.27).
Sininen fluoresenssi onkin todennäköisesti tyypillinen lähes kaikille bio-orgaanisille aineille, kun viritys tehdään riittävän lyhytaaltoisella UV-valolla. Myös GFP:n aikakäyttäytymistä tutkittiin ja tulokseksi saatiin, että vihreän fluoresoivan proteiinin fluoresenssi on prosessi, jonka nopeus on nanosekunnin luokkaa.
Skorpioni kuuluu hämähäkkieläimiin. Lähes kaikki skorpionilajit fluoresoivat voimakkaasti vihreää väriä, kun niitä valaistaan pitkän aallonpituusalueen UV-valonlähteellä (UV-A) (kuva 8.28).
Skorpionien ohella fluoresenssi-ilmiötä esiintyy siiroilla, tuhatjalkaisilla ja kovakuoriaisilla.
Skorpionin fluoresenssi-ilmiö löydettiin vuonna 1956. Skorpionin fluoresenssin aiheuttajasta ei ole tarkkaa tietoa, mutta fluoresenssin arvellaan johtuvan skorpionin kuoren pintakerroksen mukosakkarideista ja proteiineista. Äskettäin löydettyjen muinaisten skorpionifossiilien on myös havaittu fluoresoivan tätä vihreää väriä. Toisaalta vastasyntyneet skorpionit eivät fluoresoi. Tästä on päätelty, että skorpionin fluoresenssi-ilmiö johtuu skorpionin altistumisesta auringonvalolle, jolloin tietyn prosessin kautta skorpioni alkaa fluoresoida. Se, mihin skorpioni fluoresoivaa ominaisuuttaan käyttää, ei myöskään ole varmaa. Tutkijat arvelevat skorpionin fluoresenssin liittyvän skorpionien keskinäiseen kommunikointiin. [24,25].
Kuva 8.29 esittää kuolleesta tunisialaisesta Saharan autiomaan skorpionista (Androctonus) Perkin-Elmer-fluorometrillä mitattua emissiospektriä. Viritysaallonpituutena käytettiin aallonpituutta 200 nm ja raon leveytenä oli 15 nm.
Kuvaajassa nähdään hieman alle 500 nm kohdalla kaksois-emissiopiikki, joka vahvistaa sen havainnon, että skorpioni fluoresoi vihreää väriä vielä kuoltuaankin.
Fluoresenssia esiintyy myös meressä. Ensimmäisenä merieliöiden fluoresenssin huomasi vuonna 1927 englantilainen C Phillips. Hän oli kävelemässä Torbayssa meren rannalla ja huomasi vuoroveden mukanaan tuoman merivuokon olevan poikkeuksellisen vihreän. Hän vahvisti fluoresenssihavaintonsa valaisemalla merivuokkoa ultravioletinpäästösuotimen läpi. Myöhemmin vuonna 1930 japanilainen Siro Kawaguti tutki Tyynellämerellä korallien pigmenttejä ja huomasi niiden fluoresoivan vihreää väriä. Hän laati tutkimuksistaan ensimmäiset tieteelliset julkaisut fluoresoivista koralleista.
Toisen maailmansodan jälkeen vuonna 1950 aloitettiin järjestelmällinen merieliöiden fluoresenssin tutkiminen tarkastelemalla merestä kerättyjä koralleja akvaariossa UV-valolla. Myöhemmin sukeltajat veivät UV-valon meren pohjaan korallien ominaisympäristöön. Vihdoin 90-luvulla amerikkalainen Charles Mazel kehitti veden alla toimivan fluorometrin, jolla myös tässä luvussa esitetyt spektrit on mitattu.
Koralleista muodostuvat trooppisten vesien riutat sisältävät fluoresoivia pigmenttejä. Eräs näistä pigmenteistä on klorofylli eli lehtivihreä, jota esiintyy yksisoluisessa symbioottisessa levässä. Tätä kutsutaan zooxanthellaeksi ja sitä on korallin pintakerroksessa. Levä lähettää syvänpunaista (piikki 685 nm) klorofyllille tyypillistä fluoresenssia. Lisäksi joillakin koralleilla on fluoresoivia aineita isäntäpinnan kudoksessa. Korallien kudoksen fluoresoivat aineet ovat edelleenkin arvoitus. Erään tutkimuksen mukaan korallien kudoksen fluoresenssi auttaa zooxanthellaen fotosynteesiä muuntamalla ympäristön valon aallonpituuksille, jotka klorofylli voi tehokkaimmin absorpoida.
Viime vuosina mittauslaitteiston kehittymisen myötä spektrisessä korallien tarkastelussa on kiinnitetty erikoisesti huomiota eksitaatioaallonpituuteen. Tämä on erittäin tärkeää, koska yhdessä korallinäytteessä voi olla monta erilaista fluoresoivaa pigmenttiä. Esimerkiksi Karibian koralleissa on neljä erilaista pigmenttiä, jotka levän klorofyllin lisäksi vaikuttavat korallin fluoresoiviin ominaisuuksiin. Jokaisella pigmentillä on oma emissioaallonpituus ja intensiteetti. Tärkeimmät emissioaallonpituudet pigmenttien emissiopiikkien mukaan jaoteltuna korallitutkimuksessa ovat 486 nm, 515 nm ja 575 nm. Pigmenttien eksitaatiospektri noudattaa samaa aallonpituussiirtymää kuin emissio Stokesin siirtymälain mukaisesti. Kuvassa 8.30 on Montastraea cavernosa-tähtikoralli normaalivalossa ja UV-valossa.
Koralleille onkin kehitetty mittausmenetelmät, joita kutsutaan erotusmenetelmäksi ja ennustusmenetelmäksi. Erotusmenetelmässä tarkoituksena on laskea matemaattisen algoritmin avulla mitatusta korallin fluoresenssin emissiospektristä kullekin pigmenteille ominainen spektri. Ennustusmenetelmän avulla on tarkoitus ennustaa minkä tahansa eksitaatiovalonlähteen vaste. Menetelmä perustuu ennalta mitattujen valonlähteitten käyttöön vertailukohtana. Kuvassa 8.31 on erotusmenetelmällä käsitelty Montastraea cavernosa-tähtikorallipolyypin emissiospektri 515 nm pigmentille. Fluoresenssin intensiteettiakselilla on mielivaltaiset arvot.
Alkuperäinen ja menetelmällä korjattu kuvaaja ovat melkein samanlaisia. Toisena näytteenä on mitattu Porites astreoides-korallia 515 nm pigmentille. Spektri on esitetty erotusmenetelmällä ja ilman kuvassa 8.32.
Erotusmenetelmää käytettäessä tulokseksi saadaan emissiospektri, jossa on sekä 486 nm pigmenttiä että 515 nm pigmenttiä. Täten erotusmenetelmän avulla saatiin myös 486 nm pigmenttiosa esille spektristä.
Kuvassa 8.33 on ennustusmenetelmällä laskettu Montastaea annularis-korallin emissiospektri 486 nm pigmentille. Näyte mitattiin virityksellä 365nm ja 450 nm.
Kuvaajasta nähdään, että ennustusmenetelmä antaa piikkien paikat oikein. Fluoresenssin intensiteetissä esiintyy hieman heittoja.
Korallien emissiospektrejä tutkittaessa huomataan, että tässäkin tapauksessa fluoresenssiemissiota esiintyy vihreän alueella huomattavissa määrin. Havainto vahvistaa käsitystä, että orgaanisten aineitten fluoresenssin värinä on useassa tapauksessa vihreä.
Lisää kuvia fluoresoivista merieliöistä on liitteessä 1.
